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佰利萊生物為您講解PCR反應(yīng)效率低值解析
發(fā)表時間:2024-06-14佰利萊生物為您講解PCR反應(yīng)效率低值解析
反應(yīng)效率視為實(shí)時熒光定量PCR 分析設(shè)計(jì)和優(yōu)化的關(guān)鍵因素。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(通過對目標(biāo)模板進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值。該效率值可作為總反應(yīng)的“健康”標(biāo)志。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠(yuǎn)。理想的反應(yīng)效率為100%,但反應(yīng)效率在90–110% 范圍內(nèi)都是可以接受的。
確定某個特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(模板稀釋的范圍應(yīng)涵蓋所有未知樣本),然后查看該范圍內(nèi)的效率。它應(yīng)盡可能接近100%。熔解曲線出現(xiàn)多個峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著反應(yīng)源物質(zhì)之間存在競爭作用,這必將對反應(yīng)效率產(chǎn)生影響。一旦確定反應(yīng)被抑制或效率較低,則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi)。
1、對于抑制作用,可去除模板濃度zui高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到110% 以下,則分析良好。
2、另一種解決方案是重新純化模板。切記應(yīng)延長干燥時間,以去除乙醇沉淀過程中的乙醇,或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。
3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單,但在某些情況下,隨著分析復(fù)雜度的提高,優(yōu)化過程可能十分耗時費(fèi)力。
4、擴(kuò)增單個產(chǎn)物時,將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應(yīng)效率,但當(dāng)出現(xiàn)競爭作用時,則應(yīng)降低鎂的濃度。
5、在某些情況下(主要是多重反應(yīng)中),必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì)。此時,需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度,有時甚至還需檢測探針比值,以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間,而探針濃度則在100nM至400nM 之間。
6、根據(jù)引物的Tm 值,確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當(dāng),且引物設(shè)計(jì)時使之有相似的Tm 值。